Учебное пособие создано группой широко известных физиологов, долгое время работавших в ведущих лабораториях мира. Авторы обобщили свой педагогический опыт и представили основные современные методы физиологии, которые используются в учебном процессе иностранных и ряда российских университетов в качестве самостоятельных лабораторных работ для студентов-медиков и биологов и широко применяются в научно-исследовательской работе. Руководство может служить учебным пособием для студентов медицинских и биологических факультетов университетов, а также для ординаторов, аспирантов и молодых специалистов, желающих повысить свою квалификацию.
Список сокращений
Предисловие
Вступление
Благодарности
Глава 1. Методы микроэлектродных исследований клеток
и межклеточного взаимодействия.
Введение
1.1. Микроэлектроды, их изготовление и основные характеристики
1.2. Типы соединения микроэлектродов
1.3. Хлорирование электродов
1.4. Электронно-измерительная аппаратура для микроэлектродных исследований
1.4.1. Предварительный усилитель
1.4.1.1. Входное сопротивление
1.4.1.2. Коэффициент усиления
1.4.1.3. Цепь компенсации входной емкости
1.4.1.4. Рабочий диапазон входных напряжений
1.4.1.5. Смещение постоянной составляющей
1.4.1.6. Ток утечки
1.4.1.7. Полоса пропускания
1.4.1.8. Время нарастания
1.4.1.9. Частота среза
1.4.2. Измерительная схема
1.4.2.1. Блок калибровки сигналов
1.4.2.2. Блок регулировки постоянной составляющей потенциала
1.4.2.3. Блок определения нуля
1.4.2.4. Блок измерения сопротивления микроэлектрода
1.4.2.5. Заземление системы для микроэлектродных исследований клеток
1.4.2.6. Борьба с помехами
1.5. Электронно-измерительная схема для стимуляции клеток
Заключение
Цитируемая литература
2.2. Patch-пипетки
2.3. Принципы измерений тока в конфигурации whole-cell
2.4. Принципы измерений тока, протекающего через одиночные каналы
Цитируемая литература
Глава 3. Методика перфузии срезов мозга и особенности изучения его клеток методом patch-clamp
Введение
3.1. Приготовление срезов мозга
3.2. Метод "слепого" patch-clamp
3.3. Patch-clamp в срезах мозга при помощи метода очищения
3.4. Использование инфракрасного света для идентификации клеток на срезах мозга
3.5. Возможности применения конфигурации whole-cell на срезах мозга для регистрации К+-токов
3.6. Флуоресцентные маркеры на срезах мозга - возможностьзличать типы клеток a priori
3.7. Комбинирование метода patch-clamp и метода обратной транскрипции для молекулярного анализа одиночной клетки
3.7.1. Общие правила работы в лаборатории с применением молекулярно-биологических методов
3.7.2. Коллектирование клеток из срезов мозга для дальнейшего анализа
3.7.3. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция на одиночном нейроне
3.7.4. Предотвращение возможных ошибок при анализе мРНК одиночной клетки
3.7.5. Применение электрофизиологического подхода в сочетании с анализом экспрессии генов одиночной клетки для описания нейронов миндалины
Заключение
Благодарности
Цитируемая литература
Рекомендованная литература
4.2. Постановка задачи и выбор индикатора
4.2.1. Что измерять: концентрацию Са2+ или нечто, пропорциональное ей?
4.2.2. Сродство зонда к Са2+ и величины ожидаемых изменений [Са2+]
4.3. Загрузка индикатора
4.3.1. Способы загрузки
4.3.2. Какова необходимая и достаточная внутриклеточная концентрация зонда?
4.3.3. Рекомендуемый протокол загрузки
4.4. Выбор времени экспозиции и частоты измерений
4.5. Загрузка определенного типа клеток
Цитируемая литература
Глава 5. Флуоресцентно-микроскопические методы оценки функционального состояния и выживаемости нейронов
5.1. Регистрация внутриклеточной концентрации свободных ионов Са2+, Nа+ и Н+
5.1.1. Измерения концентрации свободных ионов Са2+ ([Ca2+]i)
5.1.2. Изменения концентрации свободных ионов Nа+ и H+ (рHi)
5.1.2.1. Измерение внутриклеточного рН (pHi)
5.1.2.2. Измерение внутриклеточного натрия
5.2. Оценка выживаемости (гибели)нейронов
5.2.1. Морфологические методы оценки выживаемости нейронов
5.2.1.1. Применение флуоресцентных витальных красителей
5.2.2. Биохимические методы
5.2.2.1. Анализ выживаемости клеток по восстановлению солей тетразолия и сопоставление его с методом подсчета клеток, окрашенных флуоресцирующими красителями
5.2.2.2. Высвобождение лактатдегидрогеназы как индикатор повреждения и гибели клеток
Заключение
Примечание
Цитируемая литература
Глава 11. Оптическая регистрация электрической активности сердца с помощью флуоресцентных красителей
Введение
11.1. Проблемы, решаемые с помощью оптических методов
11.2. Области применения оптического картирования
11.2.1. Изучение роли пространственно-временной организации активации и реполяризации миокарда
в норме и при аритмии
11.2.2. Изучение механизмов пейсмейкерной активности синусового и атриовентрикулярного узла
11.2.3. Изучение характера проведения возбуждения в сложных многослойных трехмерных системах
(атриовентрикулярном узле)
11.2.4. Исследование эффектов внешнего электрического поля (стимуляция и дефибрилляция)
на электрическую активность клеток
11.2.5. Одновременные локальные записи трансмембранного потенциала и внутриклеточного кальция
11.3. Основы метода оптического картирования
11.3.1. Физические принципы измерения флуоресценции
11.3.2. Фармакологические эффекты потенциалочувствительных красителей
11.3.3. Артефакты оптических записей, связанные с механическим движением препарата
11.4. Системы регистрации оптических сигналов
11.4.1. Источники света
11.4.2. Оптические фильтры
11.4.3. Фотодетекторы
11.4.3.1. Фотодиодная система (photo-diode array, PDA)
11.4.3.2. ССD-камеры
11.4.3.3. Камеры на основе CMOS-матриц
11.4.3.4. Сравнение камер на основе CCD-и CMOS-технологий
11.4.3.5. Лазерные сканирующие системы
11.4.4. Система оптического картирования на основе CMOS-камеры
11.5. Программный контроль оборудования, ввода и анализа данных
11.6. Принципы анализа данных и их представления
11.7. Возможные ошибки в методике и интерпретации данных
Заключение
Цитируемая литература
Глава 12. Сокращение резистивных сосудов in vitro: методы регистрации, анализ механизмов
Введение
12.1. Зачем проводят эксперименты на изолированных сосудах?
12.2. Физиологический раствор: состав и возможные модификации
12.3. Выделение сосудов из ткани
12.4. Методы регистрации механической активности сосудов
12.5. Работа с системой wire myograph
12.5.1. Крепление препарата
12.5.2. Определение оптимального растяжения
12.5.3. Активация препарата
12.5.4. Примеры реакций
12.6. Работа с системой pressure myograph
12.6.1. Вставление канюль
12.6.2. Подбор радиального и продольного растяжения
12.6.3. Измерение диаметра сосуда
12.6.4. Регуляция трансмурального давления и потока
12.6.5. Активация препарата, примеры реакций
12.7. Удаление эндотелия
12.8. Обработка результатов
12.9. Сравнение двух методов: изометрического и изобарического
12.10. Дополнительные методики
12.10.1. Измерение мембранного потенциала
12.10.2. Измерение концентрации Са2+ в стенке сосуда
12.10.3. Измерение внутриклеточного рН
12.10.4. Исследование [Ca2+]i в отдельных клетках с использованием конфокального микроскопа
12.10.5. Биохимические исследования
12.11. Исследование ответов на раздражение интрамуральных нервных волокон
12.11.1. Раздражение нервных волокон электрическим током, регистрация механических ответов
12.11.2. Измерение концентрации норадреналина в стенке сосуда
12.11.3. Исследование симпатической нейропередачи с использованием конфокального микроскопа
Заключение
Цитируемая литературы
Предметный указатель